Хотя это приквел/продолжение Марио и Луиджи: Сага о суперзвездах, сюжет игры совершенно не связан с сюжетом ее предшественницы, с большим упором на тему путешествий во времени, в которой главные герои путешествуют между прошлым и настоящим Грибного королевства. Приключение рассказывает о Марио, Малышке Марио, Луиджи и Малышке Луиджи, которые ищут принцессу Пич, похищенную инопланетным видом, известным только как Хоморы. Геймплей сосредоточен на сотрудничестве квартета, который должен использовать свои особые качества и навыки для решения головоломок и прохождения, и включает в себя множество элементов ролевой игры, но с пошаговой боевой системой, ориентированной на точность времени. Игра значительно мрачнее по тону, чем ее предшественница, особенно по сюжету и темам. Как и ее предшественница, игра получила высокую оценку критиков за ее характеристики и комичный стиль, а также за использование двойного экрана DS и функции микрофона, хотя использование нижнего экрана в обычном мире и в битвах вызвало неоднозначные мнения. За игрой последовала следующая часть, Mario & Luigi: Bowser's Inside Story, выпущенная в 2009 году.